细胞凋亡是一个伴随着显著细胞形态学变化的生物过程。在早期凋亡阶段，细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸会翻转至细胞膜表面；而在凋亡中后期，随着细胞膜通透性的增加，一些较大分子化合物（如碘化丙啶 PI）能自由扩散进入细胞，使细胞核呈现红色荧光。

Annexin V-PI 检测原理

ag尊龙凯时提供的Annexin V是一种对钙依赖的磷脂结合蛋白，具有与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力的特性。完整的细胞膜无法透过Annexin V，而早期凋亡细胞的细胞膜同样完好，对PI不透染。然而，在凋亡的晚期，PI可透过细胞膜，使细胞核着色。因此，联合使用Annexin V与PI，可以有效区分早期凋亡细胞和其他细胞。

Annexin V-PI 检测步骤

以下是使用ag尊龙凯时流式凋亡检测试剂盒（货号：AC12L033）的操作步骤：

对照管设置

1. 空白管：诱导凋亡的细胞不加染料，用于电压调节；
2. 单染管：分别添加PI和荧光标记的Annexin V各一个单染管，用于补偿调节；
3. 实验管：诱导凋亡的细胞加本次实验的所有荧光染料；
4. 阴性管：正常培养细胞添加染料，以确认细胞状态，排除假阳性。

悬浮细胞处理

1. 在完成细胞凋亡刺激后离心5分钟，弃去上清，使用PBS轻轻重悬细胞并计数；
2. 取1~5×10^5的重悬细胞，离心5分钟，弃去上清，加入500µl结合液轻轻重悬；
3. 加入5µl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入5μL碘化丙啶，均匀混合；
4. 室温避光孵育10分钟，可使用铝箔防光；
5. 随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC呈绿色荧光，PI为红色荧光。

贴壁细胞处理

1. 将细胞培养液吸出至合适的离心管，PBS清洗贴壁细胞一次，使用胰酶细胞消化液消化细胞（建议使用不含EDTA的消化液）；
2. 细胞消化完成后，参照悬浮细胞的操作步骤进行处理。

上机检测

在染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

结果解读

通过流式细胞仪进行数据分析，结果可分为四个象限：
✔ 左上象限（Annexin V-/PI+）：细胞碎片、机械损伤细胞或其他死亡细胞；
✔ 左下象限（Annexin V-/PI-）：正常活细胞；
✔ 右上象限（Annexin V+/PI+）：晚期凋亡细胞或坏死细胞；
✔ 右下象限（Annexin V+/PI-）：早期凋亡细胞，PI无法着色，不会产生红色荧光信号。

注意事项

进行检测时，请注意以下事项：
• 贴壁细胞消化时，建议使用Accutase细胞消化液，以减少细胞损伤；
• 选择Annexin V的荧光染料时，需考虑细胞的自发荧光；
• 完成细胞染色后，禁止固定，应尽快检测；
• 进行凋亡统计时，主要统计早期凋亡的比例，而非仅统计晚期凋亡。

通过使用ag尊龙凯时的流式凋亡检测试剂盒，研究人员能够有效评估细胞凋亡的状态，为生命科学研究提供重要依据。