ag尊龙凯时大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肺泡巨噬细胞NR8383

生长特性：贴壁、悬浮混合生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：F12K + 20% FBS + 1% P/S

传代方法：首次建议以1:2的比例进行传代，通常每2天换液一次。

备注：悬浮细胞需离心收集，贴壁细胞则按贴壁方式处理。用无菌离心管收集冻存液以备过渡培养。

二、细胞处理

收到细胞后，当细胞状态良好时，可以将其灌满完全培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。

收到细胞后，需用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后放于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后方可进行处理。请使用显微镜观察细胞生长情况，并拍照保存不同倍数的细胞图像（建议分别拍摄40x、100x、200x），前三天的照片是重要的售后依据，若未提供照片，则视为收到状态良好。

（传代后建议使用一瓶原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，便于对比培养。换液时请松开瓶盖。）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若细胞的汇合度未超过80%，需将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml的完全培养基，放入37℃、5% CO2孵箱中培养；若细胞密度超过80%，便可进行传代培养。

1）对于贴壁细胞的传代：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞消化状态。待细胞大部分变圆并脱落时，迅速轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出悬液，转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

2）对于悬浮细胞的传代：

1. 方法一：收集细胞，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后混匀，将细胞悬液按1:2的比例分到新的含8ml完全培养基的新瓶中。
2. 方法二：选择半数换液方式，弃去一半的培养基，轻轻悬起剩余细胞，将细胞悬液按1:2的比例分到新的含8ml完全培养基的新瓶中。

b. 细胞冻存

1. 待细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，显微镜下观察细胞状态，待细胞变圆后加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，转移悬液至15ml离心管中并在1000rpm下离心5分钟。
3. 弃去上清液，沉淀细胞后加入1ml的ag尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后置入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如果后期需转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放超过24小时后再转移。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速放入37℃水浴中解冻，直至无结晶。随后用75%酒精消毒冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清液，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养；次日更换为新鲜的完全培养基。

四、注意事项

部分细胞在贴壁时不牢固，运输过程中可能会发生脱落，这是正常现象。如果脱落情况较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，在1000rpm下离心5分钟，收集上清用于过渡培养。沉淀后添加1-2ml胰酶，轻轻吹打后消化1-2分钟，随后加入5ml完全培养基终止消化。再离心并弃去上清，加1-2ml完全培养基进行重悬。接着，按1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

五、售后条款

1）细胞出现问题时可重发的情况包括：

1. 运输过程中的各种问题，如细胞丢失、瓶身破损、培养液泄漏等。
2. 细胞污染问题，需在收到产品48小时内提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货的细胞在静置24小时后，干冰冷冻的细胞解冻后24小时内大部分细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片）。
4. 干冰发货细胞解冻24小时后或常温发货细胞静置4小时且未开封后出现污染。
5. 细胞活性问题，需在收到产品7天内提供真实实验结果，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活力，核实后重发。
6. 收到细胞当天及第2、3天内拍照，若3天内未告知，视为产品合格。
7. 若4-7天内出现问题，须提供收到前3天的照片及操作详细步骤，由技术人员判定责任后可重发。

2）细胞出现问题时不予重发的情况包括：

1. 客户造成的细胞污染。
2. 客户不当操作导致细胞状态不良。
3. 非推荐培养体系导致的细胞状态不良。
4. 细胞状态不良而未提供前三天的照片。
5. 培养过程中进行其他处理的细胞。
6. 收到细胞后2天内未告知。
7. 视具体情况而定。

通过以上步骤和注意事项，确保ag尊龙凯时大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的培养及处理能够顺利进行，从而为您的研究提供有效支持。